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84農(nóng)業(yè)網(wǎng) 時間：2018-03-14 作者：佚名 來源：網(wǎng)絡整理
1、樣品采集標準方法
1.1 采樣器具：眼科剪刀、眼科鑷、牙刷、樣品容器(1.5毫升塑料離心管、5―10毫升青霉素小瓶、5―10毫升小試管、5―20克小藥瓶等小型具塞容器均可)、標簽紙、鉛筆、樣品記錄(記錄簿或紙張)、燒杯或水杯、滴管、SEMP采樣液、l摩爾／升HCl、1％一5％新配制的高錳酸鉀或漂白粉。
1.2 采樣部位
1.2.1 親蝦：瀕臨死亡的親蝦或己冰凍的親蝦，采取少量蝦胃，每樣品重0.1―2克。
1.2.2 各生長期對蝦：采集蝦胃，對于3厘米以下樣品可取蝦頭。每樣品在0.1―2克。
1.3 操作步驟
1.3.1 清洗干凈各種器具、采樣容器(用過的容器清洗后，用1摩爾／升HCl浸泡2小時，再充分洗凈)。
1.3.2 預先在每個采樣容器中加入0.5毫升的SEMP采樣液。
1.3.3 各種與樣品直接接觸的金屬器具在用于處理下一個樣品前都必須用牙刷刷洗干凈后，在5％新配制的高錳酸鉀或漂白粉溶液中浸泡5分鐘以上，再用清水洗滌干凈后使用，以消除交叉污染。
1.3.4 按上述樣品采集重量要求用鑷子、剪刀采集樣品，放入采樣容器中，與采樣液混勻。一份樣品放入一個采樣容器。不能互混。
1.3.5 用鉛筆在標簽上寫上編號，放入采樣容器內(nèi)或牢固地粘在采樣容器上。
1.3.6 在樣品記錄上詳細寫明①樣品編號，②樣品種類名稱，③個體數(shù)量，④采集地點，⑤采集時間，⑥保存方法，⑦現(xiàn)場問題，⑧采樣單位，⑨采樣人。
2、需自備的器材和物品
扁頭鑷子1把，剪刀1把，碾磨棒1個，微型臺式離心機1臺，吸水紙1合，80℃恒溫箱1臺，60℃、70℃水浴鍋1臺，朔料封口機1臺，電爐及杯子1只，泡末朔料板1塊，不透光盒子1個，計時器或手表1只，移液器或吸管若干，碎冰筷若干，蒸餾水、小燒杯、試管、橡皮塞、量筒若干。
3、準備樣品
取樣品或蝦的胃置于微型離心管中，加入0.3mg研磨液，用研磨棒將樣品充分磨碎。
4、檢測操作
4.1 泡膜、點樣和交聯(lián)
4.1.1 泡膜：用蒸餾水和泡膜液分別泡雜交膜5和10分鐘，然后置于吸水紙上晾干。
4.1.2 樣品變性：將研磨好的樣品稍離心，分別取少量上清液置于微型離心管中，編號，注意加上陽性對照樣品和陰性對照樣品；填寫《樣品檢測結(jié)果記錄表》中的“樣品說明”欄。然后將所有樣品插在泡沫塑料板上，于100℃沸水中煮沸10分鐘；再迅速置于碎冰塊中2分鐘以上，直到點樣。
4.1.3 點樣：用點樣管吸取變性樣品上清，先點樣于測試膜的一個方格內(nèi)，再在參照膜相對應的方格內(nèi)亦點樣，然后置于吸水紙上自然晾干。
4.1.4 交聯(lián)：將點樣后晾干的雜交膜夾于兩層吸水紙中間，在80℃恒溫箱中烘烤2小時。
4.2 預雜交和雜交
4.2.1 配制預雜交液：將封閉劑完全溶解于預雜交母液中配成預雜交液。
4.2.2 預雜交：將兩張雜交膜分別置于兩個雜交袋中分別加入配制好的預雜交液，用塑料封口機封口，注意趕盡袋中氣泡，檢查雜交袋是否密封，在70℃水浴中孵育0.5―2小時。
4.2.3 探針變性：將探針于100℃水浴煮沸10分鐘。立即置于冰水中2分鐘以上。
4.2.4 雜交：將變性的探針加入測試膜雜交袋中，封口，將兩雜交袋在70℃水浴中繼續(xù)孵育過夜。
4.3 加入抗體
4.3.1 洗滌：用清洗液I將測試膜和對照膜洗滌2次，每次5分鐘。
4.3.2 洗滌：用清洗液II將測試膜和對照膜洗滌2次，在60℃水浴中，每次15分鐘。
4.3.3 洗滌：用緩沖液A將兩張雜交膜洗滌2分鐘。
4.3.4 封閉：將兩張雜交膜分別置于兩個新的雜交袋中，分別加入封閉液，封口，室溫下放置30分鐘。
4.3.5 加入抗體：將抗體(抗―DIG―AP)加入兩雜交袋中，室溫振蕩30分鐘。
4.4 顯色、觀察和記錄結(jié)果
4.4.1 洗滌：用緩沖液A洗滌兩張雜交膜2次，每次15分鐘。
4.4.2 洗滌：用緩沖液B洗滌兩張雜交膜1次，2分鐘。
4.4.3 配制顯色液：將顯色劑A、B加入到緩沖液B中，混勻。
4.4.4 顯色：將兩張雜交膜分別置于兩個新的雜交袋中，分別加入顯色液，封口，置于暗盒中(或避光)顯色30分鐘至2小時。
4.4.5 終止顯色：顯色過程中可隨時取出雜交膜觀察顯色情況、觀察后立即放回暗處。當測試膜上陽性對照樣品明顯出現(xiàn)顏色而雜交膜本底剛有所變色時，立即剪開顯色袋，倒去顯色液，取出雜交膜，在蒸餾水或自來水中漂洗15―30分鐘，終止顯色。
4.4.6 觀察、記錄：將雜交膜置于吸水紙上晾干，對光觀察結(jié)果，記錄，詳細填寫《樣品檢測結(jié)果記錄表》。如雜交膜上陰性對照樣也現(xiàn)色，則需重做。
5、結(jié)果判斷
根據(jù)雜交膜的顯色情況來判斷：以陽性對照樣顯出的顏色為標準，樣品的顏色與陽性對照顏色相同或相近，則樣品為病毒攜帶者；樣品的顏色比陽性對照顏色深，則樣品為已發(fā)病或臨死狀態(tài)；樣品不顯出顏色，則樣品為不帶病毒。
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